我在上海美吉生物进行龙虾转录组高通量454测序,美吉公司要求我构建cDNA文库时去POLY-A,请问为什么?

来源:学生作业帮助网 编辑:作业帮 时间:2018/11/20 03:32:30
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454测序技术用的是焦磷酸方法,焦磷酸测序技术原理如下:
一、1个特异性的测序引物和单链DNA模板结合,然后加入酶混合物(包括DNA Polymerase、ATP Sulfurylase、Luciferase和Apyrase)和底物混合物(包括APS和Luciferin).
二、向反应体系中加入1种dNTP,如果它刚好能和DNA模板的下一个碱基配对,则会在DNA 聚合酶的作用下,添加到测序引物的3’末端,同时释放出一个分子的焦磷酸(PPi).
三、在ATP硫酸化酶的作用下,生成的PPi可以和APS结合形成ATP;在荧光素酶的催化下,生成的ATP又可以和荧光素结合形成氧化荧光素,同时产生可见光.通过CCD光学系统即可获得一个特异的检测峰,峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比.
四、反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在Apyrase的作用下发生降解.
五、加入另一种dNTP,使第2-4步反应重复进行,根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息.
从焦磷酸测序原理可以看出,测序仪是根据加入碱基后可见光信号的有无判断是何种碱基,通过强弱来判断碱基的数量.当测序样品中存在某一连续碱基(如PolyA等)的情况时,信号强度会特别强,CCD无法识别具体有几个碱基,会造成错读.另外454测序板上的孔与孔之间距离很近,信号过强的话会影响临近孔的信号,形成所谓“鬼影子”.所以454测序一定要去除Poly结构.

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